(资料图)

介绍： 为了探究靶向CD19抗原的对套细胞淋巴瘤（MCL）的体外杀伤作用，通过构建靶向CD19的CAR-T与CAR-NK细胞，使用LDH释放法检测其对MCL的杀伤效果，使用流式细胞术验证杀伤效果。实验可得，CAR-T与CAR-NK对MCL细胞和K562-CD19细胞的杀伤效果明显，对K562细胞几乎无杀伤反应。可以得知CAR-CD19-T和CAR-NK-92-MI细胞在体外对MCL有较强的特异性杀伤作用。 套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)是一种具有特殊临床和病理表现的小B细胞非霍奇金淋巴瘤,在非霍奇金淋巴瘤中约占6% 。多数临床进程是具有侵袭性且难治愈, 多数患者的生存期仅约4年。目前，使用常用的信号通路抑制剂效果不佳，仅1/3患者可得到缓解，1/3患者出现耐药。 CAR结构中的scFv使得T/NK细胞可特异性识别肿瘤细胞；CD3ζ的ITAM序列可有效激活T细胞进而提高其杀伤能力。第一代CAR-T具有CD3ζ，有持续性与杀伤能力；二代CAR具有CD3ζ与1个共刺激分子（CD27、CD28、CD134、CD137等），增加了体内生存与增殖能力；三代CAR具有CD3ζ与2个共刺激分子（通常为CD28与CD137）。

实验：

【成功构建CAR-NK-92MI细胞和CAR-CD19-T细胞】图1A为将CAR插入慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-CopPuro上，酶切位点是Xba I与Not I。

图1B为对NK-92MI与T细胞分别进行转染，CAR-NK-92MI细胞分选后阳性率为99.9%；CAR-CD19-T细胞为53.4% 。 图1C为检测CAR-CD19-T细胞的CD8表达程度以探究其杀伤性。由图可得，CD8⁺T占51.9% 。 图1D为检测CAR-NK-92MI细胞表面的CD56蛋白表达与CAR-CD19-T细胞表面的CD3蛋白表达。可见CD56表达率为97.9%；CD3为87.6% 。 【构建的靶细胞表面高表达CD19抗原】图2为检测靶细胞的细胞表面CD19蛋白表达。 由图可见，图2A中MAVER-1的CD19表达率为94%；图2B中JeKo-1为76.6%；图2C中K562-CD19稳定表达，为97.2%；图2D中K562为CD19阴性，无表达。 【CAR-NK-92MI细胞对MCL细胞有很强的特异性杀伤能力】图3为使用LDH释放法检测CAR-NK-92MI细胞与NK-92MI细胞在不同效靶比对不同靶细胞的杀伤能力。 图3A可见，在效靶比为0.25:1时，CAR-NK组对靶细胞MAVAR-1的杀伤能力是NK组的2倍；在效靶比为2:1时，CAR-NK组的杀伤效果仍高于NK组30% 。 图3B、C可见，CAR-NK对靶细胞JeKo-1与K562-CD19的杀伤效果强于NK。 图3D可见，CAR-NK与NK组对靶细胞K562D的杀伤效果并不大，且无显著差异。 结果表明，CAR-NK-92MI对表达CD19抗原的MCL细胞有特异性杀伤能力。【CAR-CD19-T细胞对MCL细胞具有极强的特异性杀伤能力】图4为使用LDH释放法检测CAR-CD19-T细胞与T细胞在不同效靶比对不同靶细胞的杀伤能力。 图4A可见，在效靶比为0.25:1时，CAR -T组对靶细胞MAVAR-1的杀伤能力是T细胞组的5倍。 图4B、C可见，CAR-T对靶细胞JeKo-1与K562-CD19的杀伤效果强于T组。在效靶比为2:1时，CAR-T组的对JeKo-1的杀伤率为80%，T细胞则低于40% 。 图4D可见，CAR-T与T细胞对靶细胞K562D的杀伤无显著差异。 结果表明，CAR-CD19-T对表达CD19抗原的MCL细胞有特异性杀伤能力。【流式细胞术检测证实CAR-CD19-T细胞对MCL细胞具有强毒性】图5A、B为通过使用流式细胞术检测CFSE/7-AAD的表达量以检验各效靶比下的CAR-CD19-T细胞对靶细胞MAVAR-1或JeKo-1的杀伤能力。其中，上行为T细胞，下行为CAR-T细胞。 由图可见，CAR-CD19-T细胞对MAVER-1与JeKo-1的杀伤能力强于未修饰的T细胞。

结论：

实验中构建的靶向CD19的CAR-NK-92-MI和CAR-CD19-T细胞，对MCL细胞系的MAVER-1与JeKo-1均有较强的杀伤性，CAR-CD19-T细胞的杀伤能力在流式细胞术检测与LDH释放结果一致，说明实验使用的单链抗体对CD19抗原有很强的亲和力。此外，CAR-CD19-T细胞在杀伤时会释放多种毒性细胞因子（穿孔素、颗粒酶等），对靶细胞的杀伤起重要作用。在时间方面，CAR-NK-92-MI细胞对MCL细胞的杀伤时间为8h，CAR-CD19-T细胞为18h。对于CD19抗原特异性，CAR-T/NK-92-MI可以显著杀伤K562-CD19，而在杀伤K562则无显著差异。实验成功进行了CAR-T/NK-92-MI对MCL的体外杀伤实验，为临床治疗MCL提供了参考依据。 来源：赵松柏, et al.\"靶向CD19抗原的CAR-NK-92MI和CAR-CD19-T细胞对套细胞淋巴瘤的体外杀伤.\" 中国肿瘤生物治疗杂志. DOI：10.3872/j.issn.1007-385x.2018.05.003 默赛尔生物微信平台来源：默赛尔生物研发部 主编：默赛尔生物研发部 E-mail：wechat@morecell.com.cn

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